Hastaya verilen az miktarda penisilin bakterilerin üremesini yavaşlatır; çok miktarda alındığında ise bakterileri öldürür. Penisilin sürekli çoğalan bakterilerin hücre çeperlerinin gelişmesini durdurur. Hücrelerin içindeki basınç, çeperinin patlamasına yol açar. Bakterilerin etkilenmesinin nedeni penisilinin bakteri hücrelerinin çeperlerine tutunabilmesidir.
Penisilinin etkilediği organizmalar sayısız ve çok çeşitlidir. Bu organizmalardan bazıları streptokoklar, stafilokoklar, pnömokoklar, gonokoklar, menengokoklar, difteriye yol açan mikroplar ve treponemalardır.